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特性說明：

產(chǎn)品說明：

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Transfection Reagent)是一款多用途轉(zhuǎn)染試劑，適用于核酸(DNA、RNA)的轉(zhuǎn)染，能在絕大多數(shù)貼壁和懸浮細胞(哺乳動物細胞系)提供高效轉(zhuǎn)染。獨特的配方使其能直接加入培養(yǎng)基，血清的存在不會影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后無需去除DNA- 轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物或更換培養(yǎng)基，也可根據(jù)自身需求在轉(zhuǎn)染4-6h后更換新鮮培養(yǎng)基。

本品以無菌液體形式提供，濃度為1mg/ml.通常情況下，對于24孔板的DNA轉(zhuǎn)染，每次用2μl左右, 則1.5ml轉(zhuǎn)染試劑約可轉(zhuǎn)染750個孔;對于24孔板的siRNA轉(zhuǎn)染，每次用1μl左右， 則1.5ml轉(zhuǎn)染試劑約可轉(zhuǎn)染1500個孔;

注意事項：

1）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑要求細胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細胞毒性造成的影響；如果你研究的基因要求比較長的表達時間，比如細胞周期相關(guān)基因，或者細胞表面蛋白，最好選擇細胞鋪板密度要求較低的轉(zhuǎn)染試劑，不適合用脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑。

2）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基。但是，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時要求用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，因為血清會影響復(fù)合物的形成。另外，要檢測所用的無血清培養(yǎng)基與脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。

3）轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素。

4）使用高純度的DNA或RNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵。

5）陽離子脂質(zhì)體應(yīng)該在4度保存，要注意避免多次反復(fù)長時間開蓋，因為可能會導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率。

6）初次使用應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和陽離子脂質(zhì)體試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例，通常推薦是1:2-1:3，比如24孔板內(nèi)接種0.5-2×105個細胞，使用0.5 μg DNA和1-1.5 μL 轉(zhuǎn)染試劑。通過調(diào)整DNA/脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑比例優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率，保證細胞密度大于90%，DNA（μg）: 轉(zhuǎn)染試劑比值在1：0.5-1：5。

操作流程（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積請參考表一）

注：轉(zhuǎn)染試劑使用量受細胞類型及其他實驗條件影響，建議初次使用時設(shè)置梯度進行優(yōu)化最佳使用量。

貼壁細胞：轉(zhuǎn)染前一天（20-24小時），胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板（不含抗生素），使其在轉(zhuǎn)染時密度為90-95%（0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate）。

懸浮細胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制DNA復(fù)合物之前，24孔板中細胞鋪板，每500 μL生長培養(yǎng)基（不含抗生素）中加入4-8 × 105 cells。

1. 按照以下體系配制DNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物：

1）對于每孔細胞，使用50 μL無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋0.5 μg DNA?；靹?。

2）對于每孔細胞，使用50 μL無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋0.6-2.5 μL 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑稀釋后室溫孵育5 min（在30 min內(nèi)同稀釋的DNA 混合，保溫時間過長會降低活性）。

注意：即使脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑使用OPTI-MEMⅠ稀釋，細胞也可以使用DMEM 培養(yǎng)。如果DMEM 作為脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑的稀釋液，必須在5 min內(nèi)同稀釋的DNA混合。

2. 混合稀釋的DNA和稀釋的脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑（總體積100μL），輕輕混勻，并在室溫（15-25℃）孵育20 min，使得DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成。此時溶液可能會混濁，但不會影響轉(zhuǎn)染。

注意：DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物室溫至少穩(wěn)定保存5h。

3. 直接將100 μL DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)板每個孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。

注意：如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進行細胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為500 μL無血清培養(yǎng)基。

4. 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48 h，直至進行轉(zhuǎn)基因表達分析，無需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基。然而，可能有必要在4-6 h后更換生長培養(yǎng)基，不會降低轉(zhuǎn)染活性。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株：轉(zhuǎn)染24 h后，按照1：10或更高比例在細胞中加入新鮮生長培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后加入篩選培養(yǎng)基。

懸浮細胞株：在細胞中加入DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物后，如果需要可以4 h后加入PMA和/或PHA。對于Jurkat細胞，PHA和PMA的終濃度分別為1 μg/mL和50 ng/mL，可以提高CMV啟動子活性和基因表達。對于K562細胞，只加入PMA足以提高啟動子活性。

轉(zhuǎn)染體系的調(diào)整

對于不同的細胞培養(yǎng)板，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、DNA、細胞和培養(yǎng)基的使用量會有所不同，具體請參考下表（表一）。對于96 孔板培養(yǎng)，不需要提前一天進行細胞鋪板，可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將細胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了，這樣進一步減少了轉(zhuǎn)染時間。這種改進步驟已經(jīng)過293-H，293-F，COS-7L和CHO細胞的試驗，同傳統(tǒng)方法相比活性稍低?？旖莸牟襟E和蛋白表達細胞系的高效轉(zhuǎn)染使得脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑非常適用于96 孔板的高通量轉(zhuǎn)染，比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時表達。

表一：在不同的培養(yǎng)容器中轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑，核酸，細胞和培養(yǎng)基的用量

1 不同廠商提供的細胞培養(yǎng)板表面積可能有所不同；

2 稀釋DNA或RNAi所用的培養(yǎng)基體積。

注：該表使用量僅供參考，具體使用量還需根據(jù)細胞類型及其他實驗條件進行優(yōu)化。使用時DNA（μg）:轉(zhuǎn)染試劑（μL）比值保持在1:0.5-1:5。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。