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產(chǎn)品說明：

使用說明：

產(chǎn)品描述：

Fura-2，細(xì)胞生物學(xué)常用的一種鈣熒光探針，能特異性地結(jié)合Ca2+（結(jié)合比例為1:1），同時(shí)可發(fā)出熒光，結(jié)合Ca2+后的最大激發(fā)波長(zhǎng)從結(jié)合前的380 nm向340 nm（Ca2+飽和時(shí)）偏移，其發(fā)射熒光強(qiáng)度與結(jié)合Ca2+的濃度存在定量關(guān)系。一般用340nm和380nm波長(zhǎng)激發(fā)Fura-2，通過使用與兩種激發(fā)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度比率來(lái)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，這種比率測(cè)量方法可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2與Indo-1已成為目前使用最廣泛的比率測(cè)量的鈣熒光指示劑。目前適用于Fura 2實(shí)驗(yàn)的設(shè)備有很多，但Fura-2特別適合于數(shù)字成像顯微鏡，使用該設(shè)備可更方便的調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)，使探針結(jié)合鈣離子后在300-400 nm的激發(fā)波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描                                Fura-2的吸收偏移，在510 nm處檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)。

由于Fura-2是極性大的酸性化合物，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為此在其負(fù)性基團(tuán)上結(jié)合乙酰氧甲酯，使其成為Fura-2/AM，該變化既增加了酯溶性又消除了負(fù)電荷，極大的提高了細(xì)胞滲透性。在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)ura-2/AM被酯酶水解成Fura-2后可與胞漿游離Ca2+可逆性結(jié)合。

操作說明：

一、需要試劑準(zhǔn)備

1）（可選）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30 min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）Hanks?balanced salt solution

二. 使用步驟

 1）Fura-2/AM儲(chǔ)存液的配制

利用高質(zhì)量無(wú)水DMSO溶解Fura-2/AM配制成1-5 mM的儲(chǔ)存液，該儲(chǔ)存液可分裝于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回溫至室溫。

【注】：① 因?yàn)镕ura-2/AM在水中的溶解性和穩(wěn)定性較差，不可用水溶性緩沖液配制Fura-2/AM儲(chǔ)存液。

② 溶解用的DMSO需要保證新鮮無(wú)水，否則將會(huì)導(dǎo)致AM 體水解，使熒光染料無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)效果。

2）Fura-2/AM工作液的配制

利用合適緩沖液將Fura-2/AM稀釋成1-5 μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 mL濃度為4 μM工作液，用1 mL 緩沖液稀釋4 μL 1 mM母液即可，混勻。

【注】：① 典型工作液濃度為0.1-5 μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

② Fura-2/AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）（可選）如果Fura-2/AM進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，可向Fura-2/AM/DMSO 溶液中加入適量20% Pluronic F127溶液，最終稀釋至其終濃度為0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fura-2/AM在緩沖液中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。

【注】：Pluronic F127可降低Fura-2/AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議將其加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

4）取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用緩沖液洗滌細(xì)胞3次。

【注】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會(huì)分解 AM 體，從而降低Fura-2/AM進(jìn)入細(xì)胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會(huì)使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

5）將Fura-2/AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。在37℃培養(yǎng)15-60 min，然后除去Fura-2/AM工作液。

【注】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30 min，看熒光效果：如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

6）用緩沖液洗滌細(xì)胞 3 次，以充分去除殘留的Fura-2/AM工作液。然后加入緩沖液覆蓋細(xì)胞。

7）37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 min，以確保 AM 體在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化作用。

8）數(shù)字成像顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞。

【注】：①某些細(xì)胞會(huì)將熒光探針被動(dòng)運(yùn)輸或分泌到胞外，在一些通過陰離子泵泄漏探針的細(xì)胞內(nèi)該現(xiàn)象尤其嚴(yán)重，此時(shí)需加入一些抑制劑防止該情況的發(fā)生，如加入適量的丙磺舒或磺吡酮。但需注意，抑制劑的加入量必須經(jīng)過優(yōu)化，過量的抑制劑也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不利影響。

②某些細(xì)胞具有自體熒光會(huì)影響結(jié)果分析，需使用未加載探針細(xì)胞做對(duì)照，在結(jié)果分析時(shí)在同一波長(zhǎng)下扣除自熒光。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并帶一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。