訂購信息
|
目錄號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
|
X10017 |
G418 Sulfate (Geneticin) 遺傳霉素（凍干粉） |
1g |
|
X10018 |
G418 Sulfate (Geneticin) 遺傳霉素（凍干粉） |
5g |
|
X10019 |
G418 Sulfate (Geneticin) 遺傳霉素（100mg/mL） |
1ml |
產(chǎn)品說明：
CAS號
108321-42-2
分子式
C20H40N4O10·2 H2SO4
分子量
692.7g/mol
純度
~98%
外觀
白色粉末
內(nèi)毒素含量
＜0.5Eu/mg
活力
>700 μg/mg
溶解性
溶于水
運輸
常溫運輸
保存
-20℃避光保存。有效期3年，避免受潮。
使用說明：
1. G418儲存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）
1）活力單位的換算
根據(jù)此公式進行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異?？梢娕螌?yīng)的質(zhì)檢報告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。
比如若所用批次的G418 活力值為：750 μg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。
如果配制10 mL的G418儲存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取663.3 mg粉末。
2）除菌和保存
根據(jù)上述換算得到的實際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其完全溶解。
先用5 mL無菌去離子水預(yù)濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。
【注】：①不要對混濁的溶液進行過濾，因為混濁的溶液意味著未完全溶解，過濾過程中會造成藥物損失，降低終液的活性。
②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機溶劑來制備儲存液。
2. 常用篩選濃度
一般來說，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長條件，細(xì)胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實驗體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來確定最佳篩選濃度。
通常情況，哺乳動物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL。
以下是一些細(xì)胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考：
|
細(xì)胞類型 |
激活濃度 |
應(yīng)用 |
引用文獻 |
|
網(wǎng)柄菌屬 |
a) 10 μg/mL |
a）培養(yǎng)在培養(yǎng)液中 |
Hirth,et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982). |
|
b) 30 μg/mL |
b）培養(yǎng)在凍干細(xì)菌上 |
||
|
哺乳動物 |
a) 400 -1000 μg/mL |
a）用于篩選 |
Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad.Sci., v. 79, 5166-5170 (1982). |
|
b) 200 μg/mL |
b）用于維持生長 |
||
|
植物 |
a) 25-50 μg/mL |
a）用于篩選 |
Ursic, et. al., Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981). |
|
b) 10 μg/mL |
b）用于維持生長 |
||
|
酵母 |
a) 500 μg/mL |
a）用于篩選 |
Jimenez and Davies, Nature,v. 287, 869-871 (1980). |
|
b) 125-200 μg/mL |
b）用于維持生長 |
||
|
細(xì)菌 |
8-16 μg/mL |
用于篩選 |
Waitz, et. al., Antimicrob. Agents Chemothe |
3. 殺滅曲線的建立
【注意事項】：
為了篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，可通過建立殺滅曲線來實現(xiàn)，至少選擇6個濃度。處理分裂期的細(xì)胞時G418的活性最強，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時間。
1) 第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜。
【注】：對于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞，可增加接種量。
2) 根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3) 第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔。
4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期（如每2天）進行活細(xì)胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選
1) 轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
【注】：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷效果最好。當(dāng)細(xì)胞過于稠密，其效率會降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。
2) 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
3) 篩選7天后觀察并評估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染以及篩選效果。
4) 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。
5) 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
注意事項：
1) 本品不可高壓滅菌；
2) G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因為它們是G418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會產(chǎn)生交叉活性。
3) 配制G418溶液時，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液及工作液。
4) G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細(xì)胞密度過高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。
5) 即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。
6) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。
